产品目录

本制品是一种通过Streptavidin-HRP及后续的BalbECL UT试剂来实现化学发光检测Biotin标记的EMSA探针的检测试剂盒。同时本试剂盒也提供了EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及一些关键的相关试剂，可以实现非同位素的EMSA检测。

本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。

本试剂盒采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。本试剂盒和百奥莱博的各种生物素标记EMSA探针可以配套使用。

本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，其它特定的生物素标记EMSA探针的制备可以使用生物素标记EMSA探针制备试剂盒。

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。

• 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。。
  
• 如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购封闭液或洗涤液(5X)。
  
• BalbECL UT A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

• 探针的标记：
  可以直接选购百奥莱博的生物素标记EMSA探针，或使用生物素标记EMSA探针制备试剂盒或其它合适的试剂盒进行EMSA探针的生物素标记。
  
• 探针的纯化和检测：
  百奥莱博的各种生物素标记EMSA探针都已经过纯化，可以直接使用；对于使用生物素标记EMSA探针制备试剂盒等试剂盒标记的EMSA探针，通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。详细的探针纯化和探针的标记效率的检测请参考EMSA探针生物素标记试剂盒的相关说明。
  
• EMSA胶的配制：
  
  • 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
    
  • 按照如下配方配制20mL 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
    

    成分	用量
    10×TBE buffer	1mL
    重蒸水	16.2mL
    39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)	2mL
    80%甘油	625μL
    10%过硫酸铵(ammonium persulfate)	150μL
    TEMED	10μL

  • 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
• EMSA结合反应：
  
  • 如下设置EMSA结合反应：
    

    阴性对照反应：
    Nuclease-Free Water	7μL
    EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
    细胞核蛋白或纯化的转录因子	0μL
    标记好的探针	1μL
    总体积	10μL
    样品反应：
    Nuclease-Free Water	5μL
    EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
    细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
    标记好的探针	1μL
    总体积	10μL
    探针冷竞争反应：
    Nuclease-Free Water	4μL
    EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
    细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
    未标记的探针	1μL
    标记好的探针	1μL
    总体积	10μL
    突变探针的冷竞争反应：
    Nuclease-Free Water	4μL
    EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
    细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
    未标记的突变探针	1μL
    标记好的探针	1μL
    总体积	10μL
    Super-shift反应：
    Nuclease-Free Water	4μL
    EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)	2μL
    细胞核蛋白或纯化的转录因子	2μL
    目的蛋白特异抗体	1μL
    标记好的探针	1μL
    总体积	10μL

  • 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20～25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20～25℃)放置20分钟。
    
  • 加入1μL EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
    注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
• 电泳：
  
  • 用0.5×TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
    
  • 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μL稀释好的1×的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
    
  • 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
• 转膜：
  
  • 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5×TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
    
  • 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5×TBE浸湿。
    
  • 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
    
  • 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
    
  • 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
    
  • 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5×TBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10×8×0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30～60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
    
  • 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
• 交联：
  
  • 用紫外交联仪选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45～60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如我司的手提紫外检测仪)，距离膜5-10厘米左右照射3～10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5～10厘米左右照射3～15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
    
  • 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3～5天，然后再进入下一步检测。如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤a的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
• 化学发光法检测生物素标记的探针：
  
  • 37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
    • 封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
  • 取一合适的容器加入15mL封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
    
  • 取7.5μL Streptavidin-HRP Conjugate加入到15mL封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
    
  • 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15mL含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
    
  • 取25mL洗涤液(5X)，加入100mL重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125mL洗涤液。
    
  • 将尼龙膜转移至另一装有15～20mL洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
    
  • 去除洗涤液，加入15～20mL洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
    
  • 重复步骤g三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
    
  • 将尼龙膜转移至另一装有20～25mL检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
    
  • 取5mL BalbECL UT A液和5mL BalbECL UT B液混匀，配制成BalbECL UT工作液。
    • BalbECL UT工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
  • 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
    
  • 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10mL BalbECL UT工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2～3分钟。
    
  • 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
    
  • 用X光片压片1～5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
  
  相关搜索：生物素标记EMSA探针检测试剂盒，Biotin标记EMSA探针检测试剂盒，EMSA探针化学发光法检测试剂盒，化学发光法EMSA探针检测试剂盒，非同位素EMSA检测试剂盒，EMSA探针ECL检测试剂盒，EMSA探针ECL试剂盒，Chemiluminescent EMSA Kit